绿色荧光蛋白的基因克隆和表达研究

摘  要:目的研究绿色荧光蛋白(Greed Fluorescent Protein,GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。方法通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP,将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达,再用IPTG诱导GFP基因表达,可以看到显现绿色,判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 结果:结果显示构建的重组质粒pET-28a-GFP在E.coli中成功表达。
关键词:绿色荧光蛋白;质粒重组;原核表达;诱导表达
中图分类号:Q53
 
Studies On Cloning and Expression of Green Fluorescent Protein gene
Abstract: Objective:Studies indicated that the cloning and expression of the GFP gene in the E.coli.  Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N3) and DH-5α (pET-28a). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pET-28a-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR transfected into E.coli DH-5α  to ensure the expression of green fluorescent protein. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of GFP into E.coli for expression, through transformative method. The expression of GFP gene can be induced by the IPTG and then we can see green. Results: The results suggest that pET-28a-GFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli.
Keywords: Ged Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression
 

绿色荧光蛋白的基因克隆和表达的研究

引言

    随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。  
    基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注,现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 
     2008 年10 月8 日,瑞典**科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白的发现者和推广者。他们分别为日本科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔菲(Martin Chalfie)和钱永健(Roger Tsien)[3]。1962 年,下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素,并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年,他们分离得到了这个蛋白,当时称绿色蛋白,以后称绿色荧光蛋白(GFP)[4] 。1994 年,查尔菲等**在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP,开创了GFP 研究与应用之先河[5]。   
    绿色荧光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238 个氨基酸组成的单体蛋白,其分子量为27 kDa。GFP 作为一种新的报告基因,与以往lacZ、CAT 等报告基因相比,有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高,稳定性高;不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测;另外GFP 分子量小,易于融合,适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠;并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 6~7] 。采用GFP 作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 8、9 ] 。采用基因工程手段生产GFP 标记的方法,可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[10] 。
质粒转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞是分子克隆的关键步骤[11],是基因克隆以及DNA文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器,而利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞,操作方便、应用广泛.目前, 感受态细胞的制备主要采用CaCl2 法, 该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高, 可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列,并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA 的渗入[12]

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